一、简述
臭氧有很高的能量，很不稳定，在常温，常压下，臭氧结构易变，很快自行分解为氧和单个氧原子。后者具有极强的氧化作用，臭氧的半衰期为22~25min。生成臭氧的原料主要是空气和电能。臭氧杀菌机制：（1）作用于细胞膜，导致细胞膜的通透性增加，细胞内物质外流，使细胞失去活动；（2）使细胞活动必需的酶失去活性；（3）破坏细胞内的遗传物质或使其失去功能。臭氧杀灭病毒是通过直接破坏核糖核酸或脱氧核酸完成的。而杀灭细菌、霉菌类微生物则是臭氧首先作用与细胞膜，使细胞膜的构成收到损伤，导致新陈代谢障碍并抑制其生长，臭氧继续渗透破坏膜内组织，直到死亡。不同洁净室可根据其体积，选用适当的臭氧发生器，将主机设置在 HVAC系统的送、回风主管道中或净化空调箱的中效过滤器后端的合适位置，电源控制系统置于机房内。消毒时，关闭新风进口（或关闭约90%的新风进口阀门）和回风对外排放阀门，是整个被消毒的洁净室空气通过净化系统风道形成内循环状态。每天开机1~1.5h进行空气灭菌；替代化学药剂熏蒸消毒及设备表面灭菌需开机2~2.5h。10万级别的洁净区，臭氧投加浓度为10MG/M3。臭氧衰减率为0.375。按空间的大小投加量计算：臭氧发生器产量=体积*10/0.375按这计算出来的臭氧发生器产量，基本的能达到10万级别洁净区的洁净标准。
二、目的
制剂的生产过程主要在洁净区完成，洁净区用臭氧灭菌的效果直接影响到产品的质量，为确认臭氧灭菌的可靠性,用臭氧灭菌取代甲醛熏蒸灭菌，减少对员工身体健康的损害，特制订本验证方案进行验证。验证过程应严格按照本方案规定的内容进行,若因特殊原因确需变更时,应填写验证方案变更申请及批准书,报验证小组批准。
三、工艺原理图
将臭氧气体引到送风主管道中，利用HVAC系统中净化风机产生的压力风源，扩散至所控制的整个洁净区域。

四、验证计划
(1)、洁净区空气消毒方法原理：
1.1 是采用臭氧发生器产生臭氧后，通过 HVAC 系统机组的正压送风段和送风管送入洁净区，再通过回风管回到机组，组成一个闭合的空气循环系统，控制消毒过程中的循环时间或密闭时间，从而使一定浓度的臭氧气体在规定的时间内，杀灭洁净区内的微生物。
1.2 为了保证消毒效果，应确保空气消毒时，HVAC 系统运行或消毒剂气体循环时，外界新鲜空气不得进入 HVAC 系统内，以防止消毒剂气体浓度下降，达不到规定的消毒浓度。
(2)、空气灭菌机理及特点：
2.1 臭氧灭菌机理及特点：
2.1.1 臭氧在常温、常压下分子结构不稳定，很快自行分解成氧和单个氧原子，后者具有很强的活性，对细菌有极强的氧化作用，可氧化分解细菌内部氧化葡萄所必需的酶，从而破坏其细胞膜，将它杀死。多余的氧原子则会自行重新结合成为普遍氧分子，不存在任何有害残留物，故称无污染消毒剂；
2.1.2 臭氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁殖体和芽孢、病毒、真菌等，并可破坏肉毒杆菌毒素。但其具有腐蚀性，臭氧为强氧化剂,可损坏多种物品,浓度越高对物品损害越重，故在利用臭氧消毒时，应对洁净区内容易被氧化或加速老化的物品（如塑料、橡胶）、产品等进行防护。
2.1.3 臭氧熏蒸消毒时，相对湿度高则效果好，低则效果差，对干燥菌体几乎无杀菌作用。
2.1.4 空气中臭氧浓度达０.01-0.02mg/L 时即可嗅知，浓度达到 1mg/L 时，可引起呼吸加速、变、胸闷等症状，在２.5-5mg/L 时，可引起脉搏加速，疲倦、头痛，停留１小时可发生肺气肿，以至死亡，故臭氧消毒时，严禁洁净区内具有人员在操作。
2.1.5 臭氧稳定性极差，常温下即可自行分解为氧，臭氧发生器停止发生后，HVAC 系统继续运行通风３０－６０分钟，使臭氧完全分解后，人员才可进入洁净区进行操作。
2.1.6《消毒技术规范》中规定，对空气中浮游菌，臭氧灭菌浓度为 2-4PPM，对物体表面的沉降菌，臭氧的灭菌浓度为 10-15PPM，臭氧 1H 的的衰退率约为 62.25%。应根据等消毒的空间体积（V）、要求杀灭微生物的浓度（C）和臭氧 1H 的的衰退率确定臭氧发生器的发生量。公式为：W（臭氧发生量）=（CV）/（1-62.25%）mg/h。
(3)、消毒频率：
3.1 10万级洁净区内的空气消毒，必须在下列情况下进行:
3.1.1 每天消毒：洁净室和 HVAC 系统日常消毒只采用臭氧消毒进行，目的是消灭空气中的浮游菌；
3.1.2 每月定期消毒：洁净室和 HVAC 系统每月消毒采用甲醛和臭氧交替使用，防止产生耐药菌株，目的是消灭环境中浮游菌和沉降菌；
3.1.3 环境监控：当洁净区内环境微生物检测结果超标时，按每月定期消毒执行；
3.1.4 停产：洁净区内停产一周以上，生产前按每月定期消毒一次。
（4）、消毒设备及消毒剂：
4.1 酒精灯，36%的甲醛溶液；
4.2 臭氧发生器、臭氧；
（5）、消毒方法：
5.1 消毒前准备工作：
5.1.1 洁净室内应进行了全面的卫生清洁工作，包括厂房、设备、容器、清洁工具等；
5.1.2 洁净室内应无中间体、半成品、原辅料的暴露存放及无操作人员；
5.1.3 用洁净抹布醮纯化水擦拭设备、墙壁的外表面，用洁净拖把醮饮用水擦抹地面，保持洁净区湿润；
5.1.4 关闭车间内所有强排风口，打开洁净区内传递窗内侧门；
5.1.5 关闭 HVAC 系统的新风口阀和全开总回风阀门。
5.1.6 臭氧和甲醛消毒前的准备工作相同，但利用甲醛时，应对与产品直接接触的设备、容器等内表面进行防护，以防止甲醛集合附着在其表面，而臭氧可不必考虑。
5.2 臭氧消毒方法：
5.2.1 HVAC 系统正常运行后,接通臭氧发生器电源，电源指示灯亮，电压表显示电压为220V；
5.3.1 将臭氧发生器按纽旋至“手动”位时,启动臭氧发生器(A、B)消毒按纽，电流表显示工作电流 3.6A，同时指示灯亮，臭氧发生器开始工作，记录开始消毒时间；
5.3.2 消毒时间：臭氧每天消毒时间为 1－1.5 小时（消灭空气中的浮游菌），每月定期消毒时间为 2－2.5 小时（消灭环境中浮游菌和沉降菌）。
5.3.3 日常消毒或每月定期消毒在规定消毒时间结束后，关闭臭氧发生器启动按纽，关闭总电源，臭氧发生器停止工作。
5.3.4 臭氧消毒结束后，洁净区内需人员进行操作时，HVAC 系统应继续运行 30min,再打开工艺排风机和新风阀补充新风，机组继续运行 30min 后，使洁净区内臭氧完全分解后，人员方可进入洁净区。
5.3.5 臭氧消毒结束后，洁净区内如不需人员进行操作（如当天生产结束后消毒），可直接关闭 HVAC 系统风机，第二天 HVAC 系统运行达到自净时间（40min）后，人员可直接进入洁净区操作。
五、验证方案
5.1 日常臭氧灭菌
5.1.1灭菌周期：3天。
5.1.2 灭菌时间
5.1.2.1 1小时
5.1.2.2 1.5小时
5.1.2.3 2小时
5.1.3 灭菌后检测(每个时间连续做三个周期的检测)
5.1.3.1 检查指标
5.1.3.1.1 检测沉降菌
5.1.3.1.2生物指示剂进行细菌挑战性试验，生物指示剂菌种选用枯草芽孢杆菌，在使用测定前要测定其初期菌数，应不少于10个。在消毒灭菌前，将装有生物指示剂表面皿置于被测房间内的中央地面，灭菌前打开表皿，灭菌结束后，回收生物指示剂放入硫乙醇酸盐液体培养基中，在37℃下培养3天。
5.1.3.2 认可标准:
5.1.3.2.1 沉降菌：100级，沉降菌≤1个/皿、1万级，沉降菌≤3个/皿、10万级，沉降菌≤10个/皿
5.1.3.2.2 生物指示剂：应无菌生长
5.1.4 沉降菌、生物指示剂检测记录见验证实施报告
5.2 大消毒
5.2.1灭菌周期：半个月。
5.2.2 灭菌时间
5.2.2.1 2小时
5.2.2.2 2.5小时
5.2.2.3 3小时
5.2.3 灭菌后检测(每个时间连续做三个周期的检测)
5.2.3.1 检查指标
5.2.3.1.1 检测沉降菌
5.2.3.1.2生物指示剂进行细菌挑战性试验
生物指示剂菌种选用枯草芽孢杆菌，在使用测定前要测定其初期菌数，应不少于10个。在消毒灭菌前，将装有生物指示剂表面皿置于被测房间内的中央地面，灭菌前打开表皿，灭菌结束后，回收生物指示剂放入硫乙醇酸盐液体培养基中，在37℃下培养3天
5.2.3.2 认可标准:
5.2.3.2.1 沉降菌：100级，沉降菌≤1个/皿、1万级，沉降菌≤3个/皿、10万级，沉降菌≤10个/皿
5.2.3.2.2 生物指示剂：应无菌生长
5.2.4 沉降菌、生物指示剂检测记录见验证实施报告
5.3 拟订再验证方案周期：
当灭菌时间、灭菌设备发生变化，或是沉降菌定期监控的数据有负面趋势的情况下，应按照前期验证采用的方法对臭氧灭菌进行再验证，或根据实际情况修补验证方案后进行再验证，以确认灭菌效果。
5.4 验证结果总评定：
5.4.1 质保部负责收集各项验证，试验结果报验证小组。验证小组负责对验证结果进行评审，做出验证结论，发放证书，并对验证结果进行评审填入“验证结果完整性总评价记录表” ,其内容包括：
5.4.1.1 验证结果是否有遗漏?
5.4.1.2 验证实施过程中对验证方案有无修改,修改原因、依据、是否经过批准？
5.4.1.3 验证记录是否完整？
5.4.1.4 试验验证结果是否符合标准要求?偏差及对偏差的说明是否合理?是否需要进一步补充试验?
5.4.1.5 偏差及对偏差的说明是否合理?是否需要进一步补充试验?
5.4.2 验证结果总评价与会签:
5.4.2.1总评价：
5.4.2.2会签
6验证方案评价及最终批准：
6.1验证方案评价：
6.2验证方案最终批准：
六、验证原始记录
沉降菌检测记录（日常灭菌）
灭菌日期 灭菌时间 沉降菌 检测日期 检测人
2010-10-14 1小时

1.5小时

2小时 15 2010-10-14 邓XX
2010-10-15 10 2010-10-15 梁XX
2010-10-16 8 2010-10-16 林XX

综合评价

该灭菌基本符合要求



确 认
QA：罗XX

日期：2010-10-17 验证小组：杨XX

日期：2010-10-17

沉降菌检测记录（大消毒）
灭菌日期 灭菌时间 沉降菌 检测日期 检测人
2010-10-18 2小时


2.5小时

3小时 8 2010-10-18 杨XX
2010-10-19 5 2010-10-19 张XX
2010-10-20 3 2010-10-20 张XX

综合评价

该灭菌基本上符合10000级的要求



确 认
QA：朱XX

日期：2010-10-21 验证小组：诸XX

日期：2010-10-21

生物指示剂检测记录（大消毒）
灭菌日期 菌落数 检测日期 检测人
2010-10-22
5 2010-10-22
邓XX
2010-10-23
4 2010-10-23
梁XX
2010-10-24
3 2010-10-24
林XX
综合评价
该灭菌基本符合要求


确 认
QC：罗XX

日期：2010-10-25 验证小组：杨XX

日期：2010-10-25
验证报告

项 目 结果分析与评价 结 论
沉降菌检查 将安装在风机送风口的臭氧发生器打开,分别以30min、45min、60min、90min灭菌后取样，其沉降菌均符合GMP要求。
合 格



整体评价 根据验证试验，我公司输液车间决定采用抽样灭菌30 min消毒，消毒效果经验证达到预期标准。
报告审核人： 林XX 日期：2010-11-4

验证总结
臭氧灭菌早被科学家研究，国家有关行业做过肯定和推荐应用，但臭氧灭菌在药品生产环境中的应用才是近几年逐渐被广泛使用。
臭氧消毒的特点
臭氧消毒灭菌方法与常规消毒灭菌方法相比具有以下特点：
（1）高效性：臭氧消毒不需要其他任何辅助材料和添加剂。消毒进行时臭氧发生装置产生一定量的臭氧，在相对密封的环境下，扩散均匀，包容性、通透性好，克服了紫外线杀菌存在的消毒死角的问题，达到全方位、快速、高效的消毒杀菌目的。另外，由于它的灭菌广谱，既可以杀灭细菌繁殖体、芽胞、病毒、真菌和原虫孢体等多种微生物，还可以破坏肉毒杆菌和毒素及立克次氏体等，同时还具有很强的除霉、腥、臭等异味的功能。
（2）高洁性：臭臭氧在环境中可自然分解为氧，这是臭氧作为消毒灭菌剂的独特优点。臭氧利用空气中的氧气产生的，消毒氧化过程中，多余的氧原子在30分钟后又结合成为分子氧，不存在任何残留物质，解决了消毒剂消毒时，残留物的二次污染问题，同时省去了消毒结束后的再次清洁。
（3）方便性：臭氧杀菌设备一般安装在室内或中央空调系统、空气净化系统中，或者是灭菌设备中。可根据灭菌所需浓度及时间，自动设置臭氧灭菌设备的定时控制，操作使用方便。而甲醛、环氧乙酸熏蒸消毒时间长，而臭氧消毒可以天天定时开启使用。
（4）经济性：通过臭氧消毒灭菌在诸多制药行业GMP中的应用，以及医疗卫生单位的使用及运行比较，臭氧消毒方法与其他方法相比具有很大的经济效益和社会效益。
经过实践应用和总结臭氧在制药行业应用广泛的有以下几个方面：
1、洁净区的消毒灭菌
我国卫生部颁布的“毒技术规范”，对臭氧的杀菌作用，使用范围及使用方法都有明确的规定。肯定了臭氧是一种广谱杀菌剂，可杀灭细菌繁殖体和芽胞、病毒、真菌等，可破坏肉毒杆菌毒素。臭氧的杀菌速度较氯快。
在制药厂洁净区面积较大，几乎都有中央空调净化系统完成对各洁净区的净化消毒。传统的消毒方法是用甲醛熏蒸，如上所说，甲醛熏蒸的弊病不少。用臭氧灭菌来代替是最简便易行的好方法。其方法极为简单，根据洁净厂房空间的大小取选标准定型的臭氧发生器。然后将臭氧发生器直接放到空调净化系统的风道中，称为内置式臭氧发生器。臭氧随着风道的气流送入各洁净区，对洁净区进行空间消毒灭菌，剩余臭氧吸入风口，由中央空调带走。也可以将臭氧发生器放置在空调机组中，将臭氧打入中央空调的风道中，然后被送到各洁净室，称为外置式臭氧发生器。外置式臭氧发生器安装检修方便，但制造成本要高一点。两种方法消毒效果是一样的。按照卫生部消毒规范，对空气消毒的臭氧浓度是5ppm,但事实上洁净区消毒不仅是对空气的消毒，实际上还包括了设备、器具等物体表面的消毒，所以一般设计浓度为10ppm，相当于每立方米空气中臭氧含量20毫克。每天上班前开机两小时，上班时关机，就可以保证一天内洁净区的浮游菌和沉降菌达到GMP的要求。
2、空间的消毒
对于有些制药生产工序当没有中央空调或者不需设中央空调，但房间内需要单独灭菌处理。方法是根据房间空间大小选取一定浓度的臭氧发生器，直接安装在房间内。根据需要设定消毒时间，消毒结束便自动关机，所以使用非常方便。
对于有洁净度要求的房间，机内装有过滤器，使臭氧发生器具有自洁功能，以达到消毒和洁净的目的。
总之，臭氧消毒到目前已在全国制药行业被广泛应用。臭氧发生器无论从产品到应用技术方面均得到了很大的提高和发展。在选用时着重要考虑自己的实际情况和适合特点，同时也要考虑其半衰性和衰退性以及投入与经济效益的关系。以便臭氧在药品行业得到更好的应用。
以上，仅从几个方面介绍了臭氧在洁净区产中的应用，可以看出臭氧在该领域内还是大有作为的。GMP验证为臭氧技术的开发提供了广阔的机遇，我们应抓住这个机遇，使其能有所突破。同时，由于臭氧灭菌工艺在药品生产过程中的成功应用，也为GMP验证提供了新型的强有力的武器，更有利于药品生产企业尽快通过GMP验证。