一 文详述:CAR-T生产全流程解决方案梳理

出处:MR 医麦客 eMedClub News
作者:张楫钦 周静
日 期:2021 年5月18日
编辑:圆圈半

近年来,随着肿瘤免疫学与基因工程的技术革新,市场规模的快速增长,免疫细胞治疗已成为全球医药行业新药研发的热门领域。特别是CAR-T细胞治疗的横空 出世,其强大的抗肿瘤治疗效果,为肿瘤免疫领域带来了革新,为更多的肿瘤患者带来了希望。
生产CAR-T细胞疗法的主要步骤包括最初分离和富集T细胞、T细胞活化、使用病毒或非病毒载体系统进行CAR基因转移、体外CAR-T细胞扩增,以及最 后的末端工艺和冷冻保存,整个制造周期一般需要2~4周。

CAR-T细胞的生产失败率范围在2-14%,失败的原因主要来自细胞的个体差异、细胞数量以及细胞质量。为最终实现CAR-T的商业 化,努力优化和质量控制生产过程的各个环节都十分重要。面对不同肿瘤患者复杂的样品来源,如何实现高效率、标准化、规模化的生产制备,在工艺上又可以通过 哪些手段或方案来满足预期的商业化需求,是CAR-T制造商共同关注的问题。

01 细胞分离和激活
1.1 细胞分离
生产CAR-T的第一步,是通过白细胞分离术从患者(或同种异体的供体)处收集外周血单核细胞(PBMC);然后利用基于磁珠的技术分离出特定的T细胞亚 群,如CD4+、CD8+、CD25+或CD62L+T细胞。
过程中既要考虑分离得到尽可能多的T细胞(回收率要高);同时要将粒细胞、红细胞、抗凝剂等对后续细胞生产有影响的杂质去掉。譬如,抗凝剂在后续的细胞激 活过程中会改变细胞的特征、红细胞会影响产品的临床效果等。

在细胞处理的过程中采用封闭式、自动化的系统已成为行业共识。这对于大规模生产制造以及生产工艺的改进是非常必要的,封闭式、自动化的 系统不仅可有效缩短细胞处理和分析的时间并提高效率,还能够减少人员接触,节省劳动力的同时也使跟踪过程更容易。
使用传统手工开放式的方法进行操作,制造周期很长,结果的稳定性较差。除此之外,污染是手工开放式方法最大的风险。患者血液样本中的T细胞数量有限,而且 细胞治疗产品的终产品不能进行除菌过滤,操作过程中一旦出现污染将是难以挽救的。

赛默飞世尔科技专门的自动化、封闭式、模块化多功能细胞处理系统Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统是非常有特色的产品,它可以用在细胞治疗生产过程当中多个步骤,包括细胞的分离、换液浓缩和洗涤等,是应用 非常灵活的细胞处理系统。系统内置用户可编程的软件、大量细胞处理的应用程序,以及用于从科学研究到商业化生产的实用程序。
Gibco™ CTS™ Rotea™逆流离心系统独特的腔室设计,可以达到非常低的输出体积(5 mL),灵活地兼容下游的应用和处理。除此以外,它还可以保障优异的细胞回收率(> 95%)和活性,同时能够轻松的整合到GMP的生产过程当中,实现从科研到商业化生产的转化。

Gibco™ CTS™ Dynabeads™ CD3/CD28 磁珠, 提供可靠的技术平台用于免疫治疗中的分离,活化,和扩增T细胞。

1.2 细胞激活
T细胞的激活通过T细胞受体(Signal 1)和CD28、4-1BB或OX40等共刺激信号(Signal 2),产生主要的特异性信号来实现。自体抗原呈递细胞,例如树突状细胞(DC),是T细胞反应的内源性激活剂。然而,DC的效力因患者而异,很难作为T细 胞激活的可靠来源。
激活会触发细胞分裂,从而促进基因转导,故细胞的激活方式与之后的基因转导效率息息相关。CD3/CD28抗体偶联的超顺磁微珠,例如 Dynabeads,是目前用于T细胞活化最广泛使用的平台之一。

CD3/CD28抗体磁珠Gibco™ Dynabeads,是可用于离体分离、活化和/或扩增T细胞的可靠技术。无论是对于多克隆T细胞、抗原特异性T细胞、基因修饰T细胞,调节性T细胞还是 其他T细胞亚型,Gibco™ Dynabeads都能使T细胞恢复到具有与体内活化T细胞相当的特性,并确保T细胞保持活力,以用于下游免疫肿瘤学分析。
使用Gibco™ Dynabeads磁珠刺激CD3/TCR和CD28信号转导途径,其活化和扩增高度一致,无需自体抗原呈递细胞 (APC)、有丝分裂原、抗原或饲养层细胞,并能够保留细胞因子谱和完整TCR,人和小鼠T细胞均可适用。

02 细胞改造

实现CAR在T细胞上的表达,是CAR-T生产的核心技术,这一步需要利用到载体将CAR基因导入T细胞。理想的载体应该具有较高的基因转染效率、稳定性 好,不引起机体免疫反应等特点。
目前有多种方法用于T细胞修饰,包括病毒载体转导(如γ-逆转录病毒、慢病毒载体等)及非病毒载体转染(转座子转染、电穿孔等技术 等)。
已上市的5款CAR-T产品以病毒载体转导的方式为主,吉利德旗下Kite的Yescarta和Tecartus采用了γ-逆转录病 毒载体,其它3款基于慢病毒载体开发,分别是诺华的Kymriah、Juno的Breyanzi,以及百时美施贵宝/bluebird bio的Abecma。

2.1慢病毒
慢病毒(LV)载体可以将外源基因或外源的shRNA有效地整合到宿主染色体上,从而实现目的序列的持久性表达。相比于其它病毒载体,使用LV载体的优势 包括其可携带相对较大的负载,且遗传元件仅在整合后才有活性;因此,可相对简单地达到所需的滴度以及获得单个整合元件。
用于将CAR转导进T细胞的LV载体,是CAR-T细胞生产过程中的关键原材料。LV规模化生产的产能、成本、质量等各方面都将直接影响着CAR-T产品 最终的治疗应用。
最终的CAR-T细胞产品需“个体化”来自于每个患者,但编码CAR的病毒载体可以大量地生产,并在-80℃长 时间储存。LV载体多采用三质粒或四质粒瞬时转染包装细胞(如293 T/17或293 T细胞)的方法进行制备,制备周期一般为2周。

LV生产的上游工艺主要包括细胞培养(分为悬浮/贴壁培养等)和病毒包装;下游工艺一般涉及澄清、纯化、过滤、浓缩、除菌等步骤。与细 胞分离步骤一样,载体的无菌性至关重要,因为最终的CAR-T细胞产物无法通过过滤进行灭菌。

目前主要存在的挑战包括LV成本高、收率低、活性容易丧失等。LV生产成本高也是CAR-T定价持高不下的一个主要原因,因此,高成本 效益的LV生产对于满足商业需求并平稳过渡到临床生产规模至关重要。
Gibco™ LV-MAX™慢病毒系统是首套完整的悬浮液生产系统,与使用聚乙烯亚胺(PEI)的慢病毒生产方法相比,该系统产量可提高十倍之 多,成本降低一半以上。Gibco™ LV-MAX™慢病毒生产系统能够达到>1 x 10^8 TU/mL(未浓缩)的高滴度,提供研究级及Gibco™ CTS™ LV-MAX™慢病毒生产系选择,后者既符合GMP医疗器械标准(21CFR第820部分),同时遵守美国药典USP <1043>**和欧洲药典Ph. Eur. 5.2.12建议。

2.2 基因编辑

目前已上市的 CAR-T细胞和大部分在研细胞免疫疗法仍然属于自体疗法。然而,自体疗法存在着成本高、等待时间长、T细胞质量参差不齐、治疗实体瘤效果不明显等局限 性,这也使得同种异体(也称为“现货型”、“通用型”)CAR-T的 开发显得尤为必要。
基因编辑技术可以实现外源基因的靶向插入或内源基因的定向敲除,精确构建CAR-T细胞,已在同种异体CAR-T疗法的开发中被广泛使用。基因编辑应用于 同种异体CAR-T,可以限制移植物抗宿主病(GVHD)和免疫排斥反应的发生,同时也能够实现CAR-T细胞功能的增强。

CRISPR/Cas9是现在应用最广泛,研究最深入的基因编辑工具。与TALENs和ZFNs相比,CRISRP/Cas9的精确性 更高,能降低脱靶效应带来的副作用,且更利于规模化生产。
从生产过程来看,同种异体CAR-T与自体CAR-T大体上类似,不同点在于同种异体CAR-T的原材料来自健康供者而非患者;另外,采用基因编辑的同种 异体CAR-T生产过程中,增加了引入基因编辑工具改造特定基因的一步。

基因编辑应用于T细胞改造的递送方法包括慢病毒、腺病毒、AAV等病毒载体递送;使用质粒或者核糖核蛋白RNP电转;使用编码Cas9 的mRNA与sgRNA共电转等。然而,需要注意的是,优化这些方法的转导效率仍是基因编辑CAR-T需要改进的方向,也是降低同种异体CAR-T生产成 本、扩大生产规模的重要因素。

Gibco™ TrueCut™ Cas9蛋白(CTS™-Prototype)是一种用于临床前研究的Cas9蛋白新标准,现已上市销售,可作为工艺过程开发期间进 行临床前研究和评价的早期测试材料。它专为临床前研究的严格要求而设计,并按照严格的指导原则进行生产,可确保质量和一致性,同时,其市场领先性能可与已 在多家细胞治疗公司的临床项目中得到应用的Invitrogen™ TrueCut™ Cas9蛋白v2相媲美。

2.3电穿孔
电穿孔是最早和应用最广泛的非病毒转染策略之一。一个短的电脉冲作用于细胞,以产生暂时的通透性,并允许编码目的基因的DNA或RNA的注入。利用电穿孔 进行mRNA转移的转导效率多在90%以上,且设计相对容易,性价比高。
除此之外,利用mRNA电穿孔介导CAR基因表达,可能相比病毒转导更为安全。与通过病毒转导或质粒DNA转染引入转基因的稳定和永久表达不同,mRNA 转移提供了一种胞质表达系统,可使T细胞实现CAR基因的瞬时表达。在此过程中,目前还没有证据表明mRNA会整合至人体基因组中,因此,插入诱变的可能 性非常低,也不会产生具有复制能力的病毒(RCR/RCL)。
Invitrogen™ Neon™ 电转染系统是新一代高效转染原代、干细胞和难转染细胞的电穿孔装置,具有灵活性、简易性和通用性等优势,让研究人员广泛受益。

03 细胞扩增和洗涤

通过基因修饰获得稳定的CAR-T细胞后,还需要进行大规模的体外扩增,才能获得达到治疗所需剂量,一般为十亿至百亿级别(根据患者体重和治疗周期决 定)。扩增T细胞仍是CAR-T疗法的关键挑战之一,有许多患者最终无法接受该疗法,原因就在于这些患者的T细胞无法在体外充分扩增,未达到目标剂量。

细胞可以通过不同的容器进行扩大,包括T瓶、平板或培养袋以及生物反应器。利用摇摆式生物反应器(例如WAVE)进行扩增,是目前主要 的培养方式;除此之外,自动化的细胞生产设备(例如CliniMACSProdigy)也能够生产出大量的CAR-T,这种自动化的设备比起摇摆式生物反 应器能大大减少人为操作。

CAR-T细胞的扩增环节还可以从培养基的使用上去优化。传统的人血清培养基价格昂贵、批间差异大、检测难,并且可能包含新出现的感染 问题,以及可能对T细胞扩增和存活有害的物质。
无血清培养基是一个很好的选择,用来源和化学成分非常清晰的原料,代替血清为宿主细胞提供营养,可以降低被外源物质污染的风险。成本方面,采用血清代替物 培养的细胞,其繁殖能力和生长能力等参数能够达到与血清培养的细胞相当,但成本降低了很多。
赛默飞的细胞培养基和试剂能够最大程度地减少污染和变异的风险,同时提供大量的可追溯性文档(包括FDA药物主文件和法规支持文件)用于监管审查,从而促 进从研究到商业化的无缝过渡。此外,赛默飞设计了具有灵活性和适应性的生物工艺容器,以便满足适用于封闭式系统的培养基和试剂的需求。

04 质量监控

目前,细胞治疗产品的质量控制分为四个大的方面,分别为安全性、纯度、效力以及均一性,这些质量控制会贯穿CAR-T生产的各个阶段。
安全性除了常规的内毒素、支原体及无菌外,如果采用病毒载体进行转导,还需保证病毒的高质量,避免存在RCR/RCL、低风险的整合特征等风险。
CAR-T的效价主要指T细胞的激活程度,由于T细胞的激活涉及一系列的细胞因子以及癌细胞的杀伤,因而真实效价往往难以获得。通常会选取有代表性的指 标,如IFN-γ的表达,来评估T细胞的激活。
CAR-T的均一性和纯度则要对不同的细胞表面标志物进行检测,包括CAR-T细胞中的非目标细胞成份和杂质并限定其比例,包括NK细胞等;以及用于鉴别 CAR-T细胞中目标T细胞的比例,例如%CD3+T细胞等。

CAR-T细胞的有效扩增和较长时间的体内存活是肿瘤治疗有效的先决条件。监控CAR-T的细胞增殖活性,让治疗持续性发挥效能。接着 是CAR-T细胞的杀伤活性评估,CAR-T专一杀瘤效力也是CAR-T治疗关键的一环。除此之外,不容忽视的是治疗过程中可能引发的细胞因子风暴等免疫 反应,常用的评估方式为流式细胞术与显微成像技术,和细胞因子等蛋白分析产品。
Invitrogen Attune NxT是一款高度智能化的流式细胞分析仪,具有专利声波聚焦技术、专业防堵塞、稀有细胞超灵敏高通量分析、顶级平顶光斑激光器等优势,其配置可达4激光 16参数,并且可配备流式自动化工作站,实现24小时无人值守自动上样。

赛默飞的Pierce显色内毒素定量试剂盒是一种高灵敏度的终点测定试剂盒,可使用变形细胞裂解物测定试剂盒准确测量并检测蛋白、肽、 核酸或抗体样品中的内毒素(脂多糖)。该试剂盒可在 0.01–0.1 EU/mL 至 0.1–1.0 EU/mL 的两个线性灵敏度范围内进行检测。

05 冻存

细胞扩增完成后,最终可能将达到~5L体积。标准流程中,回输给患者前CAR-T细胞需浓缩至一定体积并进行冻存。冻存的步骤能够允许灵活安排患者的输液 时间,以完成审查和放行所需的扩展质量控制测试。
采用经过验证的冻存方法对于大规模生产至关重要,从产品质量角度来看,冻存环节直接关系到最终回输给患者时的状态和数量,需要稳健的工艺支持,避免细胞活 性变差、细胞数量损耗、污染的发生。
因此,选择简单易操作、可更好保护细胞活力的细胞冻存液尤为重要。赛默飞提供Gibco™CTS™ Synth-a-Freeze™ 冻存液,从基础科学研究到临床研究都能够适用。Gibco™CTS™ Synth-a-Freeze™ 冻存液是一种化学成分明确、不含蛋白成分的液体冻存培养基,用于冷冻和储存各种哺乳动物细胞,包括干细胞。其操作简单并适用于当前的冻存方案,只需将该产 品解冻后添加到分离和沉淀的细胞中,等分并冷冻即可。

无论使用何种制造模式,成功的CAR-T细胞生产依赖于整体流程的优化能力,包括流程的简化、产能的规划、生产的合规性和可扩展性等。

赛默飞拥有CAR-T全流程解决方案, 是细胞免疫疗法开发过程中的全流程伙伴。在早期开发阶段,赛默飞提供GMP制造的细胞治疗相关产品及监管支持和文件记录,并提供定制细胞治疗服务。在关键 转化阶段,赛默飞提供拓展和优化协助,为临床试验做好准备。无论是致力于慢病毒载体生产还是腺相关病毒载体生产,赛默飞的病毒载体生产服务都可以帮助您实 现GMP生产目标。在商业化阶段,赛默飞具有经验丰富的专业人员团队,帮助优化细胞治疗的GMP制造流程,保护供应链,实施并验证监管和风险缓解策略。