（1.福建农林大学蜂疗研究所，福建 福州，350002；2.西藏昌都日通藏医药研制中心藏药厂，西藏 昌都，854000）
摘要：目的：优选中药临床经验方宫康舒胶囊的最佳提取精制工艺。方法：采用正交实验法L9(34)以大黄素含量作为考察指标，优选宫康舒胶囊制备过程中的提取工艺。结果：最佳水提取工艺为加8倍量水煎煮3次，每次0.5小时。结论：该制备工艺稳定、合理、可行。
关键词：宫舒康胶囊；正交实验法； 大黄素
中图分类号：R284．2 文献标识码：A
Studies on the Process for Extraction of Gongkangshu Capsules
CHEN Chang-Li 1 LIU Shi-Qin 2
(1:Apitherapy Institute of Fujian Agriculture-forestry University, Fuzhou Fujian, 350002；2: Tibetan Medicine Factory of Ritong Developing Center of Tibetan Medicine, Changdu, Tibet,854000)
Abstract：Objective: To investigate the process of the optimal extraction for Gongkangshu Capsule．Methods :Taking the content of Emodin as index, optimal extraction technology of Gongkangshu procession was formulated using orthogonal test L9(34).Results: The optimal water extraction condition was adding 8 times amount of water and boiling 3 times, 0.5 hours for each time． Conclusion: The method chosen is stable．reasonable and feasible．
Key words：Gongkangshu capsules；Orthogonal test； Emodin
宫康舒胶囊由熟大黄、生地黄、白芍、黄芩、墨旱莲、土鳖虫、水蛭、桃仁、女贞子、甘草等药组成。具有活血逐瘀，养阴清热，软坚散结的功效。用于子宫肌瘤辨证属血瘀兼阴虚火旺证的患者。根据处方中药物的性质、文献资料中药物的现代药理学研究[1]、药效学实验筛选结果，同时结合生产的可行性及生产设备等多方面的因素来制订提取工艺路线。通过药理药效学实验研究确认复方中的动物药与植物药混提为好。
处方中君药大黄主要有效成分为蒽醌衍生物，其中以蒽苷为主，极性较大，易溶于甲醇及乙醇，也能溶于水，在热水中更能溶解。地黄中主要含环烯醚萜苷类、低聚糖、多糖[2]等，易溶于乙醇、水。土鳖虫及水蛭含有大量的氨基酸，水蛭中水蛭素是一种多肽，它们均溶于水、乙醇。桃仁主含脂质体、甾体、氨基酸、黄酮及其糖苷类化合物[2]等，易溶于水、乙醇。墨旱莲全草含多种噻吩类化合物，叶中含多种内酯；女贞子中多糖为其主要有效成分，易溶于水。黄芩含黄酮类，其中以黄芩苷元、黄芩苷[5]为主要有效成分。方中绝大部分药物的主要有效成分都溶于水，因此采用水提法，并经精制除杂、在提取物中加适量辅料等工艺过程，精制成口服胶囊。
我们通过正交试验优选最佳水提工艺。
1 仪器与材料
1．1 仪器高效液相色谱仪：岛津LC-10AT，C-R6A数据处理机，SPD-10A紫外可见波长检测器，7725手动进样器，MILILIQ纯水器。754型紫外可见分光光度计(上海光谱仪器有限公司)。
1．2 药材购于成都市药材公司，经成都中医药大学中药鉴定教研室吴启南教授鉴定合格可用。
1．3大黄素（110756-200110，供含量测定用）对照品（由中国药品生物制品检定所提供）。宫康舒胶囊（批号060701、060702、060703，由成都华宇制药有限公司提供）。
1．4 试剂甲醇为色谱纯、三蒸水（自制），其它均为分析纯。其他试剂均为分析纯。
1. 5 ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂（购自北京正天成澄清技术有限公司）
2 方法
2.1 提取工艺条件的筛选
2.1.1 前处理
本试验研究所用药材均属药典规定品种。根据处方要求进行净制，切制。
3 熟大黄：取熟大黄块，切厚片。
4 生地黄：取生地黄，切段。
5 桃仁：取桃仁，捣碎。
6 黄芩：取黄芩，切段。
7 甘草：取甘草，切段。
2.1.2 提取工艺条件考察
根据处方中药物的性质和现代药理学研究，及药效实验结果，采用水煎煮法提取。影响水提因素有：浸泡时间（A）、加水量（B）、煎煮时间（C）、煎煮次数（D）。上述四个因素，各取3个水平，进行L9（34）正交实验。以浸膏得率（%）、大黄总蒽醌含量（%）、总氨基酸含量（%）为评价指标，进行综合评价，筛选出最佳提取工艺。表头设计及试验结果见表1、表2、表3。
样品制备：取2倍处方量药材，按正交试验表进行提取，滤过，滤液浓缩定容至200ml。
浸膏得率测定：精密量取上述样品液各10ml，置已干燥至恒重的蒸发皿中，在水浴上蒸干后，于105℃干燥3小时，移置干燥器中，冷却30分钟，迅速精密称定重量，计算浸膏得率，结果见表2。
总蒽醌的含量测定：采用紫外分光光度法[4-5]。
1，8-二羟基蒽醌（110756-200110）对照品溶液的配制：精密称取105℃干燥至恒重的1，8-二羟基蒽醌5mg，置25ml量瓶中，用无水乙醚溶解并稀释至刻度，摇匀；精密量取溶液5ml，置50ml量瓶中，加乙醚至刻度，摇匀，即得20μl/ml的对照品溶液。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液2.0，3.0，4.0，5.0，6.0ml，分别置于干燥具塞试管中，水浴蒸去乙醚，加5%NaOH-2%NH4OH混合碱液8.0ml，摇匀，放置30min，照分光光度法（《中国药典》2005年版一部附录V）试验，以混合碱液为空白，于535nm处测定吸收度，计算回归方程，见图2-1。
A=0.0424X+0.0082（r=0.9995） 线性范围：5～15μg
测定法：精密量取上述各样品溶液1.5ml，分别置干燥试管中，加蒸馏水1.0ml，40%FeCl3水溶液0.5ml，沸水浴上加热20min，再加入HCl0.2ml，再于沸水浴上加热水解30min，并不断振摇，完毕立即用流水冷却至室温，倾入分液漏斗中，加乙醚10ml、5.0ml萃取2次，萃取液合并，用5%NaOH-2%NH4OH混合碱液萃取2次（5.0，3.0ml），滤过，将混合碱萃取液合并于10ml具塞刻度试管中，沸水浴上加热4min驱醚，用流水冷却至室温，补加氨水至原体积，摇匀，放置30min，以混合碱液为空白，于535nm处测定吸收度，计算，即得。结果见表2。
总氨基酸含量测定：采用氨基酸自动分析仪进行测定[6]。
分析仪器：日立835-50型氨基酸分析仪。
主要色谱条件：色谱柱采用日立2619阳离子交换树脂，内径2.6mm，长150 mm，洗脱方式为4段梯度洗脱，由计算机控制。柠檬酸缓冲液为洗脱液，流速0.225ml/min，泵压110-120kg/cm2，茚三酮为显色剂，显色剂溶液流速0.3 ml/min，泵压30-40 kg/cm2,以570nm和440nm波长同时检出，色谱柱温度51℃，反应浴温度98℃，反应圈内径0.25mm，长20m，样品分析周期74min；进样体积50μl。18种氨基酸混合标样色谱分析图见附图1。
主要技术指标：最小检出量：10-10克分子/50μl，定量测定重现性RSD<2.5%。
测定法：精密量取上述各样品溶液2ml，水浴蒸干，加6NHCl110℃水解24h，过滤，滤液水浴蒸干，溶解，定容至50ml。精密量取50μl，进样，计算。结果见表2。
图1 18种氨基酸混合标样色谱分析图附
表1 正交试验因素水平表
|
水平 |
因 素 |
|
浸泡时间A（h） |
加水量B（倍） |
煎煮时间C（h） |
煎煮次数D（次） |
|
1
2
3 |
0
0.5
1 |
8
10
12 |
0.5
1
1.5 |
1
2
3 |
表2 正交试验结果表
|
试验号 |
|
因素 |
|
评价指标 |
综合评价
|
|
A |
B |
C |
D |
浸膏得率（%）
X |
总蒽醌含量（%）
X′ |
总氨基酸含量（%）
X″ |
|
1 |
1 |
1 |
1 |
1 |
8.92 |
1.40 |
4.55 |
61.22 |
|
2 |
1 |
2 |
2 |
2 |
14.97 |
1.96 |
5.27 |
79.16 |
|
3 |
1 |
3 |
3 |
3 |
21.79 |
2.76 |
5.73 |
100 |
|
4 |
2 |
1 |
2 |
3 |
20.40 |
2.55 |
5.63 |
94.86 |
|
5 |
2 |
2 |
3 |
1 |
12.32 |
1.86 |
4.88 |
73.42 |
|
6 |
2 |
3 |
1 |
2 |
18.10 |
2.02 |
5.08 |
80.37 |
|
7 |
3 |
1 |
3 |
2 |
19.93 |
2.08 |
5.42 |
84.65 |
|
8 |
3 |
2 |
1 |
3 |
20.25 |
2.26 |
5.61 |
89.40 |
|
9 |
3 |
3 |
2 |
1 |
11.64 |
1.63 |
4.67 |
67.47 |
|
Ⅰ |
240.38 |
240.73 |
230.99 |
202.11 |
|
|
|
|
|
Ⅱ |
248.65 |
241.98 |
241.49 |
244.18 |
G=730.55 |
|
Ⅲ |
241.52 |
247.84 |
258.84 |
284.26 |
CT=59300.37 |
|
R |
2.76 |
2.37 |
9.03 |
27.38 |
|
|
|
|
Y=10×（Xi/Xmax）+50×（X i′/X′max）+40×（X i″/X″max）
表3 方差分析
|
方差来源 |
离差平方和 |
自由度 |
方差 |
F值 |
显著性 |
|
SSA |
13.39 |
2 |
6.70 |
1.40 |
|
|
SSB |
9.60 |
2 |
4.80 |
— |
|
|
SSC |
124.27 |
2 |
62.14 |
12.95 |
|
|
SSD |
1124.99 |
2 |
562.50 |
117.19 |
** |
注：F0.01（2，2）=99 *P<0.01
由试验结果的直观分析及方差分析可知，影响提取效果的因素大小顺序为D> C >A > B，即提取次数>提取时间>浸泡时间>加水量。因SSB误差最小，故以SSB为误差方差。其中，提取次数对提取效果有极显著性影响，鉴于浸泡时间、加水量、提取时间对提取效果无显著性影响，为节省工时、降低成本，因此将最佳工艺定为：A1B1C1D3，即加8倍量水煎煮3次，每次0.5小时。
按上述最佳工艺条件进行验证试验（n=3），结果见表4。
表 4 验证试验结果
|
样品 |
浸膏得率（%） |
总蒽醌含量（%） |
总氨基酸含量（%） |
|
1 |
20.12 |
2.34 |
5.48 |
|
2 |
20.48 |
2.28 |
5.31 |
|
3 |
20.32 |
2.49 |
5.39 |
|
平均 |
20.31 |
2.37 |
5.39 |
验证结果表明：所筛选的工艺条件基本稳定。
2.1.3 除杂
本方采用水煎煮提取工艺。用水提取时，提取的杂质较多，如淀粉、果胶、树脂、粘液质、树胶、蛋白质、蜡质等。常用的除杂方法有高速离心、乙醇沉淀法、吸附澄清法、板框压滤法等。上述大分子杂质常以胶体溶液形式存在于提取液中，高速离心并不能使这些大分子杂质从中分离，仅除去固体小微粒，且清洗沉淀较为麻烦。乙醇沉淀法是传统常用的除杂方法，它利用药物的各种成分在水和乙醇中的溶解性差异，通过水和不同浓度的乙醇交替处理，保留生物碱盐类、苷类等既溶于水又溶于乙醇的成分，去除蛋白质、糊化淀粉、油脂、脂溶性色素、树脂、树胶等杂质。同时，它还能除去氨基酸、多肽、多糖等成分。本方含有较多动物药，其有效成分为氨基酸、多肽；生地黄、女贞子、大黄等含有增强机体免疫功能的物质——多糖，故不能用乙醇沉淀法进行除杂。板框压滤法也只能除去固体杂质，对于大分子杂质亦无能为力。据报道，ZTC1+1天然澄清剂主要去除蛋白质、蜡质、淀粉等胶体不稳定性成份，对中草药有效成份如黄酮、生物碱、苷类、皂苷类、萜类、多糖、氨基酸、多肽、维生素、矿物质等不影响；且具有费用低廉（相对于醇沉工艺），使用方便等优点。为此，决定采用ZTC1+1-Ⅱ型（固体制剂型）澄清剂[9-10]除杂作为本方的除杂方式。
影响ZTC1+1澄清剂澄清效果的因素很多，主要有加样顺序、溶液浓度、澄清剂用量等。以浸膏得率、总蒽醌保留率、总氨基酸保留率、总多糖保留率为指标，对上述影响因素进行逐一筛选。
药材提取液的制备：按处方比例称取各药材，按提取工艺所确定的条件制备提取液9500ml（1：10浓缩液）。
总多糖含量测定：采用紫外分光光度法[7-8]。
葡萄糖对照品溶液的制备：精密称取在105℃干燥至恒重的无水葡萄糖（0833-9501）对照品1.4mg，置10ml量瓶中，加水使溶解度定容至刻度，摇匀。
标准曲线的制备：精密量取对照品溶液0.2ml，0.4ml，0.6ml，0.8ml，1.0ml分别置10ml量瓶中，加水稀释至刻度。再分别精密量取各浓度的对照品溶液2ml置10ml具塞试管中，精密加入4%苯酚溶液1ml，摇匀，迅速加入7ml硫酸，振摇均匀，于40℃水浴加热30min，取出，立即置冰水中冷却5min，以4%苯酚-硫酸为空白，在490nm处测定吸收度，计算标准曲线，见图2-2。
供试品溶液的制备：精密量取各样品液适量，分别加入乙醇使醇浓度达85%，搅拌均匀，静置2小时，离心15min（4000r/min），取出沉淀，挥去乙醇，加水溶解，转移至50ml量瓶中，加水稀释至刻度。
测定法：精密量取各供试品溶液2ml置10ml具塞试管中，照标准曲线的制备项下的方法，自“精密加入4%苯酚1ml”起，依法测定吸收度，计算，即得。
Y=0.0387X-0.0687 （r=0.999） 线性范围：5.6～16.8μg
2.1.3.1 澄清剂溶液的配制
A组分溶液：称取10gA组分细粉，先用少量水搅成糊状，然后加入1000ml，溶胀24h，搅拌，用双层纱布滤过，即得1%的粘胶液。
B组分溶液：称取10gB组分细粉，用少量的1%醋酸溶液溶解并搅成糊状，然后加入1%醋酸1000ml，溶胀24h，搅拌，用双层纱布滤过，即得1%的粘胶液。
2.1.3.2 加样顺序对澄清效果的影响
据ZTC1+1-Ⅱ型澄清剂使用说明，其加样顺序有三种：①在PH<4.8环境中，按先A后B的顺序添加；②PH>4.8环境中，按先B后A的顺序添加；③在中性环境中，其添加顺序根据实验而定。经测定，提取液呈中性，故应对澄清剂A、B组分的加入顺序进行筛选。分别取前述提取液500ml两份，加热至80℃，加A、B组分各25ml。提取液1先B后A，提取液2先A后B。其结果见表5。
表5 澄清剂加样顺序对澄清效果的影响
|
提取液 |
浸膏得率(%) |
沉淀情况 |
|
1 |
16.02 |
明显的絮状物，上清液透明 |
|
2 |
18.01 |
絮状物较少，液面有小浮片 |
结果表明：澄清剂的加样顺序为先B后A。
2.1.3.3提取液浓度对澄清效果的影响
取1：2、1：5、1：10浓度的提取液各500ml，在80℃下加入B、A组分各25ml，搅拌，其结果见表6。
表6 提取液浓度对澄清效果的影响
|
提取液 |
浸膏得率(%) |
总蒽醌保留率（%） |
总氨基酸保留率（%） |
总多糖保留率（%） |
澄清情况 |
|
1：2 |
18.78 |
79.28 |
78.21 |
70.58 |
浑浊 |
|
1：5 |
17.38 |
82.18 |
81.59 |
75.85 |
较澄清 |
|
1：10 |
15.98 |
93.02 |
90.12 |
88.23 |
澄清 |
结果表明：提取液较稀时，澄清效果较佳，各项指标保留率均较高。故选用1：10浓度下进行除杂。
2.1.3.4澄清剂用量对澄清效果的影响
取1：10浓度的提取液500ml三份，在80℃下按下表加入B、A组分，搅拌，其结果见表7。
表7 澄清剂用量对澄清效果的影响
|
用量 |
浸膏得率(%) |
总蒽醌保留率（%） |
总氨基酸保留率（%） |
总多糖保留率（%） |
澄清情况 |
|
2% |
19.01 |
90.89 |
91.23 |
85.47 |
微浑浊 |
|
5% |
16.10 |
91.22 |
90.12 |
87.59 |
澄清 |
|
8% |
18.64 |
90.14 |
89.56 |
83.25 |
较澄清 |
结果表明：5%用量下，浸膏得率较低，且各指标保留率较好。故选用5%用量进行除杂。
综上所述，将除杂最佳工艺确定为：提取液浓缩至1：10，在80℃下以5%的澄清剂用量按先B后A的顺序加入，搅拌，离心，即得。并按此条件验证三批，结果见表8。
表8 ZTC1+1澄清剂除杂验证试验结果
|
批次 |
浸膏得率(%) |
总蒽醌保留率（%） |
总氨基酸保留率（%） |
总多糖保留率（%） |
澄清情况 |
|
1 |
16.12 |
91.01 |
90.45 |
86.89 |
澄清 |
|
2 |
15.97 |
90.88 |
89.92 |
88.36 |
澄清 |
|
3 |
15.88 |
89.86 |
90.42 |
85.77 |
澄清 |
|
平均 |
15.99 |
90.25 |
90.26 |
87.01 |
—— |
2.1.4 浓缩与干燥
将浸膏浓缩至相对密度为1.30-1.35（60℃测定）后进行减压干燥（60℃，0.06KPa），即得干浸膏。粉碎后得干浸膏粉。
以上十味药材，加8倍量水煎煮3次，每次0.5小时，滤过，合并滤液。药液浓缩至一定程度，加澄清剂搅拌，离心。取清液浓缩至相对密度为1.30-1.35（60℃测定）的稠膏，减压干燥，粉碎成细粉，过80目筛。加入淀粉适量，混匀。用乙醇适量制粒，60℃干燥，整粒，填充胶囊，制成1000粒，即得。
2.1.5 中试
按上述工艺中试三批，结果见表9、表10。
表9 中试生产数据（一）
|
批号 |
药材投料量（kg） |
干浸膏量（kg） |
干浸膏得率（%） |
干浸膏细粉量（kg） |
粉碎收率（%） |
颗粒量（kg） |
颗粒收率（%） |
|
060701 |
38 |
6.06 |
15.95 |
5.77 |
95.28 |
6.76 |
97.60 |
|
060702 |
38 |
6.16 |
16.21 |
5.87 |
95.24 |
6.83 |
96.96 |
|
060703 |
38 |
6.08 |
16.01 |
5.81 |
95.56 |
6.77 |
97.10 |
|
平均 |
38 |
6.1 |
16.06 |
5.82 |
95.36 |
6.79 |
97.22 |
表10 中试生产数据（二）
|
批号 |
成品应得数（粒） |
成品实得数（粒） |
成品率（%） |
|
060701 |
20000 |
18923 |
94.62 |
|
060702 |
20000 |
19244 |
96.22 |
|
060703 |
20000 |
19059 |
95.30 |
|
平均 |
20000 |
19075 |
95.38 |
结果表明：中试生产的三批样品均较稳定，说明所拟定的工艺稳定可行。
2.1.6 根据正交试验结果，总结工艺流程为：
加8倍量水煎煮3次
熟大黄、生地黄、土鳖虫、水蛭等 药液
每次0.5小时，滤过
滤液 浓缩至1：10，加澄清剂适量，搅拌，离心
滤渣弃去
沉淀（弃去） 药液
浓缩，减压干燥，粉碎成细粉
装胶囊，检验，包装 成品
浸膏粉
颗粒 加淀粉适量，混匀，用乙醇适量制粒，60℃干燥，整粒
3 讨论
3.1关于利用利用澄清剂除杂的问题
在中成药大生产过程中，醇沉是较传统而又常用的方法，而本制剂中含有多糖、氨基酸、多肽等活性成分，若醇沉除杂会被当成杂质除去，而澄清剂（ZTC1+1）在除杂的同时，能保留这些物质，故想到用澄清剂除杂。
3.2药液相对密度、温度和搅拌条件对除杂效果的影响问题
试验过程中，做了提取液浓度对澄清剂效果的影响，结果表明1：10条件下作用较佳，应该测定1：10条件下药液的相对密度，这样大生产更易控制。温度一般在80℃保温加澄清剂。稍加搅拌即可，这两项试验还有待于以后工作中作进一步的研究。
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