真核表达和原核表达


blueski推荐 [2012-6-3]
出处:prestoivy的空间
作者:不详
 

在各种表达系统中,最早被采用进行研究的是原核表达系统,这也是目前掌握最为成熟的表达系统。该项技术的主要方法是将已克隆入目的基因DNA片段的载体(一般为质粒)转化细菌(通常选用的是大肠杆菌),通过IPTG诱导并最终纯化获得所需的目的蛋白。其优点在于能够在较短时间内获得基因表达产物,而且所需的成本相对比较低廉。但与此同时原核表达系统还存在许多难以克服的缺点:如通常使用的表达系统无法对表达时间及表达水平进行调控,有些基因的持续表达可能会对宿主细胞产生毒害作用,过量表达可能导致非生理反应,目的蛋白常以包涵体形式表达,导致产物纯化困难;而且原核表达系统翻译后加工修饰体系不完善,表达产物的生物活性较低
为克服上述不足,许多学者将原核基因调控系统引入真核基因调控领域,其优点是:
①根据原核生物蛋白与靶DNA间作用的高度特异性设计,而靶DNA与真核基因调控序列基本无同源性,故不存在基因的非特异性激活或抑制
②能诱导基因高效表达,可达105倍,为其他系统所不及;
③能严格调控基因表达,即不仅可控制基因表达的“开关”,还可人为地调控基因表达量
因此,利用真核表达系统来表达目的蛋白越来越受到重视。目前,基因工程研究中常用的真核表达系统有酵母表达系统、昆虫细胞表达系统和哺乳动物细胞表达系统。

1. 最根本的区别是原核表达系统的表达系统是原核细胞; 真核表达系统则是在真核细胞里例如酵母细胞, 昆虫细胞, 哺乳动物细胞中表达.

2,两种表达系统都是通过含有原核或者真核启动子以及其他其他表达相关元件的质粒系统来实现外源基因的表达.

3,原核表达系统与真核表达系统相比,表达量效率便于优化调整,表达量高. 但用来表达真核来源的外源基因时,由于蛋白折叠和糖链修饰不同,因此其应用受限. 真核表达系统表达量相对较低, 虽然酵母和昆虫系统表达量相对较高,但是在表达哺乳细胞来源基因同样存在折叠和糖链修饰的不足.。

基因表达系统有原核表达系统和真核表达系统。基因在原核表达系统表达应注意的问题:

(1)、要构建一个合适的原核表达载体的基本要求:

①有一个强的启动子及其两侧的调控序列;

 ②有SD序列及SD序列与起始密码子之间要有合适的距离;

③在克隆基因与启动子之间有正确的阅读框架;

④外源基因下游加入不依赖ρ因子的转录终止区。

(2)、编码基因要完整,没有插入序列;

(3)、将真核基因克隆到原核基因中,以保证产物表达的稳定性;

(4)、克隆基因中保留信号肽序列,使表达产物自细菌分泌到溶液中,有利于产物的分离纯化。

 

2、真核基因在哺乳动物细胞中的表达由于在原核细胞中真核基因不能进行内含子的自我剪接,表达的蛋白质不能进行翻译后加工,不能进行正确折叠,使表达产物量少,活性低,因此目前倾向于用哺乳动物细胞表达系统表达大部分基因(当然也包括在昆虫细胞以及酵母细胞中,不过从使用频率上看还是哺乳动物细胞居多并且更为实用)。哺乳动物细胞表达真核基因应注意的问题:

(1)、根据研究目的选择合适的载体-宿主表达系统。哺乳动物表达系统分为瞬时与稳定表达系统两类。瞬时表达系统用于根据产物活性来证实分离基因,从cDNA文库中筛选基因,诱变对蛋白质生物活性与功能的影响的分析等研究;稳定表达系统用于大量生产蛋白质产品。

(2)、选择合适的细胞系不同的培养细胞系摄取和表达外源基因的能力相差非常大。同一基因在一种细胞系上有效,但在另一种细胞系中可能完全不表达。